定量Q-PCR-ELISA檢測(cè)技術(shù)的相關(guān)原理講解
定量Q-PCR-ELISA檢測(cè)技術(shù)是通過熒光染料或熒光標(biāo)記的特異性的探針，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記跟蹤，實(shí)時(shí)在線監(jiān)控反應(yīng)過程，結(jié)合相應(yīng)的軟件可以對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行分析，計(jì)算待測(cè)樣品模板的初始濃度?？捎糜趍RNA、microRNA、lncRNA等基因表達(dá)量的檢測(cè)。
類似于DNA的天然復(fù)制過程，其特異性依賴于與靶序列兩端互補(bǔ)的寡核苷酸引物。PCR由變性--退火--延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成：
1.模板DNA的變性：模板DNA經(jīng)加熱至94℃左右一定時(shí)間后，使模板DNA雙鏈或經(jīng)PCR擴(kuò)增形成的雙鏈DNA解離，使之成為單鏈，以便它與引物結(jié)合，為下輪反應(yīng)作準(zhǔn)備；
2.模板DNA與引物的退火(復(fù)性)：模板DNA經(jīng)加熱變性成單鏈后，在溫度降至55℃左右時(shí)，引物與模板DNA單鏈的互補(bǔ)序列配對(duì)結(jié)合；
3.引物的延伸：DNA模板--引物結(jié)合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP為反應(yīng)原料，靶序列為模板，按堿基配對(duì)與半保留復(fù)制原理，合成一條新的與模板DNA鏈互補(bǔ)的半保留復(fù)制鏈重復(fù)循環(huán)變性-退火-延伸三過程，就可獲得更多的“半保留復(fù)制鏈”，而且這種新鏈又可成為下次循環(huán)的模板。每完成一個(gè)循環(huán)需2-4分鐘，在一個(gè)由計(jì)算機(jī)控制的循環(huán)加熱器上經(jīng)過三十個(gè)循環(huán)，就可以把原來(lái)的樣品地?cái)U(kuò)增了2的30次方倍。擴(kuò)增產(chǎn)物的量可用下列公式表示：C＝C0(1+P)n。
其中：C為擴(kuò)增產(chǎn)物量,C0為起始DNA量,P為擴(kuò)增效率,n為循環(huán)次數(shù)。
在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)，減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。
每一循環(huán)經(jīng)過變性、退火和延伸，DNA含量可增加一倍（理論上）。對(duì)于某些擴(kuò)增片段很短的PCR反應(yīng)，即使Taq酶活性不是*也能在很短的時(shí)間內(nèi)復(fù)制完成，因此可以改為兩步法，即退火和延伸同時(shí)在60℃-65℃間進(jìn)行，以減少一次升降溫過程，提高了反應(yīng)速度。
